大鼠牙移动牙周膜神经纤维

牙周膜具有丰富的机械感受神经末梢分布[1]，能够提供作用于牙齿上力的强度及方向的信息[2]，同时也分布有伤害性感受神经纤维[3]。正畸治疗常导致患者的不适或疼痛[4]，但是对牙齿移动中牙周神经的变化的研究尚处于初步的阶段[5]。在牙齿移动中，牙周膜压力区是一个过度压缩的区域[6]，Ohtake[7]用镀银法观察到牙周神经存在一个损伤、变性而后增生的过程。另外目前发现有许多神经肽如降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物质(substance P,SP)分布于牙周组织中[8],并且参与了正畸性牙周组织变化的始终，但是对其变化情况各个学者的观点并不一致。Saito[9]观察到牙齿移动一天后CGRP-IR神经数目增加，7天后恢复，而Nakamoto[10]发现牙齿移动6-12小时CGRP-IR及SP-IR神经纤维数量减少，3-7天后恢复，Vandevska[11]证实在加力7天时根尖牙周膜内CGRP-IR及蛋白基因产物（protein gene product9.5）免疫反应神经密度增加，至21天时恢复。以上结果的不同主要是由于实验方法的不同所致。镀银法结果常常不可靠而且是非特异性的[12]，而神经肽免疫组织化学染色法干扰因素较多，本实验采用抗突触素(synaptophysin,SYN)免疫组织化学染色观察压力侧牙周膜神经纤维变化。
材料与方法

1.     主要试剂与仪器

        免抗人SYN多克隆抗体                 DAKO  DENMARK
        SABC试剂盒                                    武汉博士德生物工程有限公司
        速眠灵（846液）                            长春动物研究所
        CH型光学显微镜                            OLYMPUS   JAPAN
        BH-2型显微照相系统                     OLYMPUS   JAPAN
        细金刚砂钻                                      登士柏公司
        正畸测力计（精确到1g）              瑞士
        正畸用结扎丝（0.2mm直径）       陕西钢铁研究所医疗器材厂
        
2      动物分组

        选用40只健康雄性SD大鼠（本校实验动物中心提供），体重200±20g，分笼饲养，自由摄食、饮水。饲料为本校实验动物中心提供的普通块料，每12小时交换昼夜节律，适应性喂养一周后进行实验。大鼠随机分为两大组:正常对照组和牙齿移动组。在牙齿移动组根据不同加力时间分为以下几个亚组：1h组、3h组、12h组、2d组、3d组、7d组、14d组。

3       制备动物模型

        本实验动物模型制备采用Vandevska-Radunovic方法[11]，大鼠用乙醚吸入麻醉固定后，用带尖细金刚砂车针的涡轮机在上颌左侧第一磨牙颈缘磨沟，深约0.2mm，以利于结扎丝的固定，在上颌中切牙上粘结带有拉钩的带环，用结扎丝把一根镍钛螺旋拉簧扎在第一磨牙上并与带环相连，加力力值为50g，使第一磨牙向近中移动，大鼠每天检查一次，若有损坏脱落及时安装，每隔一周加力一次。正常对照组大鼠不加任何矫正装置。

4      样本固定及免疫组织化学染色

        各组动物到达规定时间后，用速眠灵（0.8ml/kg）深麻，开胸经左心室插管至升主动脉进行灌注固定，先用100ml生理盐水洗净血液，再用含40g/L多聚甲醛及0.02%戊二醛的0.1mol/LPBS（PH7.4）500ml灌注固定。取上颌骨浸入上述的固定液内固定24h，4mol/L甲酸和0.5mol/L甲酸钠溶液脱钙5d，去除多余组织块保留磨牙及牙周组织，入含30%蔗糖的0.1mol/LPBS中过夜（4℃）。按近远中方向做冰冻切片，片厚40μm。按ABC法进行漂染[31]。切片分别入：（1）兔抗人SYN血清（1：150），孵育48h（4℃）；（2）Biotin结合的山羊抗兔IgG（1：100），室温孵育2-4h；（3）SABC复合物稀释液中（1：100），室温孵育2-4h，最后用DAB呈色，1%明胶裱片，自然干燥，梯度洒精脱水，二甲苯透明，DPX胶封片，观察第一磨牙近中牙周组织并照相。用正常羊血清代替一抗，进行完全相同的免疫组织化学染色。
结果

1      动物情况

        实验组大鼠体重在加力装置固定后持续增长（5.2±1.4g/d），对照组在同时期体重增长为5.8±1.6g/d，大鼠在观察期间无明显饮食及行为异常。

2            抗体替代对照实验组

        抗体替代对照实验组均为阴性结果。

3      正常牙周膜

        光镜下SYN阳性纤维为棕色，呈细丝状，背景无色或有淡黄色本底。牙周膜SYN-IR神经在牙周膜内数量丰富，而在根尖1/3处更多，其来源为根尖神经的分支，也有一部分穿过牙槽骨壁的孔洞进入牙周膜，部分神经向牙骨质方向不规则走行并发出树枝状分支，也可观察到游离神经末梢及Ruffini小体样结构，部分神经末梢接近牙骨质（图1-1）。

4       实验组

        本实验中螺簧的作用力拉第一磨牙近中移动，牙根近中为压力侧，远中为张力侧。1h、3h、8h 组牙周神经纤维与对照组相比无明显变化；2d组压力侧神经纤维明显少于对照组，神经纤维主要表现为染色性低下、颗粒状分解变性（图1-2），张力侧神经纤维数量轻度减少、染色变淡。3d组压力侧神经纤维比2d组更少，多数神经纤维变性消失，仅可见一些较细的游离神经末梢残留，张力侧与2d组相同（图1-3），7d组压力侧及张力侧神经纤维都较3d组增多，一些游离神经末梢增生，14d组压力侧及张力侧神经纤维数量基本恢复至对照组水平（图1-4）。

讨论

        大鼠属啮齿类动物，磨牙均为多根牙，结构与特性均类似于人类的牙齿，大鼠上颌第一磨牙有5个根，且分叉较大，大鼠上颌磨牙有向远中方向的生理移动[14]，以切牙的支抗拉上颌第一磨牙近中移动时需要较大的力。据研究用40g或60g的持续力时移动效果较好，所以本实验选用50g的力观察受力变化[15]。
         突触素属于神经脊相关抗原，分子量为38000，为存在于几乎所有神经的小突触囊泡的膜成分。Pannone[16] 报导在成人牙髓中存在SYN阳性神经的分布，但是在牙周膜中是否含有SYN阳性神经未见报道，本实验可清晰地观察到牙周膜内具有丰富的SYN阳性神经，数量较神经丝蛋白阳性神经纤维多[17]，表明SYN阳性神经元更能代表牙周膜神经纤维的情况。
       目前大多数关于正畸牙周神经改变的研究主要是神经肽免疫组织化学研究[9.10.11]，这些研究表明神经肽参与了正畸牙周组织变化的始终[18]，但由于其干扰因素较多，各家实验结果并不一致，甚至得出相反的结论[9.10]，并且神经肽的变化并不代表神经纤维本身数量的变化，所以本实验选用作为神经纤维固有成分的SYN标记牙周神经可以更真实地反映正畸力作用下牙周神经纤维的变化情况。
       在正畸力作用下，牙周膜发生一系列的变化，Rygh[19.20.21]发现用持续力移动鼠牙，6-12小时后压力侧出现透明性变区，2-3天形成大面积的透明性变区，3-4天透明性变区逐渐减少，而被相邻的正常组织所代替。本实验结果显示：正畸力作用两天后压力侧SYN神经纤维颗粒状变性，染色性降低，数量减少，说明有部分神经受到损伤，3d后压力侧神经纤维数量降至最低，张力侧牙周膜神经纤维轻度变性，而后直至14天压力侧和张力侧神经纤维数量逐渐升至正常，表明牙周膜神经纤维的改变与牙周组织的变化相一致，提示牙周神经参与了牙周组织的损伤、改建过程的始终，并在其中发挥了重要作用。
       疼痛是正畸治疗中常见的现象，几乎所有的病人在戴入固定矫治器后都会感到一些疼痛[22]，加力2-3小时后