Ti-75合金对人成骨细胞的生长、增殖和功能分化的影响

    Ti-75合金对人成骨细胞的生长、增殖和功能分化的影响

    研究Ti-75合金对人成骨细胞生长、增殖和功能分化的影响。方法：将传至第5代的人成骨细胞接种于Ti-75合金表面进行培养，在不同培养时间进行细胞计数，计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，检测细胞裂解产物中的碱性磷酸酶(ALPase)活性和蛋白质含量。结果：培养于Ti-75合金表面的人成骨细胞在24 h贴壁率达到84.38%，细胞ALPase活性和蛋白质合成量在培养第7天后出现明显增大趋势,各项指标同作为对照组的纯钛相比，均无显著差异。结论：Ti-75合金具有与纯钛相同的良好骨组织生物相容性，适于作为骨内种植材料应用。

     关键词：种植材料；成骨细胞；细胞培养

在生物材料领域中,钛及钛合金以杰出的生物相容性和良好的耐腐蚀性等优点,占据了非常重要的地位。Ti-75合金是中国西北有色金属研究院近年研制出的一种新型钛合金,其强度介于纯钛和Ti-6Al-4V之间,不含钒,机加工性能优于纯钛，是作为骨内种植的良好备选材料。近年来,由于细胞培养和分化提纯技术的研究进展,为观察骨细胞和生物材料的相互作用提供了一个有效的手段〔1〕，应用细胞培养的方法,建立骨一种植体界面的体外模型,对成骨细胞在种植材料表面的吸附、分化等表达特点进行研究,使在细胞和分子水平上研究生物材料与生物组织的相互作用成为可能。本研究即是采用上述方法，研究Ti-75合金对人成骨细胞的生长和功能分化的影响，以评价Ti-75合金作为骨内种植材料应具有的骨组织生物相容性〔2〕。

1　材料和方法

1.1　实验材料
Ti-75合金、TA2纯钛(西北有色金属研究院提供)；人成骨细胞（本院中心实验室提供）等。

    1.2　实验方法

    1.2.1　试件处理　Ti-75合金及TA2加工成直径15 mm,厚1 mm的圆片试件，经喷砂、清洗后，高温高压消毒,分别置于经放射线消毒的24孔细胞培养板中。整个操作过程中均以钛钳夹持试件,防止异种元素污染。
1.2.2　成骨细胞贴壁率的测定　 d=15 mm的Ti-75和TA2试件分别放于24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度: 4×104个/ml，每孔加入0.5 ml。DMEM培养液中含有体积分数(φ)为10%胎牛血清、50 μg/ml L—抗坏血酸。放入二氧化碳培养箱37 ℃,饱和湿度,φ(CO2)=5%培养。分别于培养 1、2、8、24 h后各取出3个孔,去除细胞培养液，0.01 mol/L PBS清洗3次，2.5 g/L胰酶0.25 ml /孔消化3 min，加0.25 ml细胞培养液中和胰酶,细胞计数板计数细胞,每孔重复4次,取平均值。贴壁率计算公式为:贴壁细胞数/接种细胞数×100%。

    1.3　成骨细胞生长曲线的测定

d=15 mm的 Ti-75和TA2试件放于 24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度:2×104个/ml，每孔加入0.5 ml，培养液同前。分别于1、4、7、10 d各取出 4个孔,进行细胞计数,绘制生长曲线。
1.4　成骨细胞功能、分化指标检测。

细胞培养方法同1.3，接种后第1天始,每3 d换液一次,取4、7、10、14 d4个点进行培养,每时间点4个孔，用于制备细胞裂解液。制备细胞裂解产物: 吸去培养液，0.01 mol/L PBS清洗细胞3次,细胞裂解液(体积分数为0.02%Triton X-100,0.3 mmol/L PBS, pH7.2～7.4)200 μl，4 ℃下放置24 h。
1.4.1　细胞层碱性磷酸酶(ALPase)活性测定　 细胞裂解产物100 μl加入反应底物(对硝基苯磷酸盐PNPP，Mg2+) 150 μl， 37 ℃孵育30 min,加入0.4 mol/L NaOH 100 μl终止反应,酶联免疫仪检测吸光度值,波长为410 nm。

    1.4.2　细胞层蛋白质含量测定　 细胞裂解产物20 μl加显色液(50 g/L考马斯亮蓝 G250、φ(乙醇)=2.375%、42.5 g/LH2PO4)200 μl，混合均匀10 min，酶联免疫仪测定吸光度值,波长为595 nm。

2　结　果

    2.1　Ti-75合金表面成骨细胞贴壁率的测定

接种于Ti-75合金表面的人成骨细胞在前2 h的贴壁率为45.31%，到 24 h贴壁率达到84.38%(图1)。与TA2相比，在各个培养时间的细胞贴壁率二者无明显差异。

    2.2　细胞生长曲线

Ti-75与TA2表现出近乎相同的生长特点,培养第1天,细胞数为1.51×104,至第7天,细胞增长为3.31×104个,第 10 d时,细胞数达到8.23×104个。(图2)。

    2.3　细胞的功能分化指标

细胞 ALPase活性和蛋白质合成量由吸光度值表示。从图3、4可看出,上述指标在培养第7天后出现明显增大趋势。

图1 不同培养时间Ti-75和TA2表面成骨细胞的贴壁率培养时间

图2 Ti-75及TA2表面人成骨细胞生长曲线培养时间

图3 Ti-75及TA2表面细胞层ALPase活性培养时间

图4 Ti-75及TA2表面细胞层蛋白质含量