神经生长因子对促进种植体骨结合的研究进展

神经生长因子对促进种植体骨结合的研究进展

种植体－骨界面的结合是牙种植修复成功的前提，然而许多研究表明种植体周围成骨细胞分化障碍和新骨形成受损等影响到种植体-骨界面的正常愈合，使得种植术后需要较长的愈合和修复时间，而且也有研究认为种植体与天然牙不仅在生物力学方面，还在神经生理方面存在显著差异。

近年来，越来越多的学者使用外源性促骨结合物质促进种植体骨结合，但许多外源性物质（如成纤维生长因子等）在体内很容易被酶水解，在体内生物半衰期短。因此，制作长效足量的生物制剂、改良种植体表面及内部结构并应用于临床，将成为研究的热点。NGF（Nerve growth factor，NGF）是一种具有营养神经元和促进神经突起生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，它能够有效地促进种植体周围骨结合。

1.NGF的分子学结构及生物学效应

1952年Levi-Montalcini发现的第一个神经营养因子为NGF，它是一种由3种不同类型的蛋白质组成的复合物。其受体分为两类，一类是高亲和力受体TrkA，它与NGF结合后能引起该受体分子在细胞表面发生二聚体化，激活受体细胞酪氨激酶活性而产生作用，属功能性受体；另一类是低亲和力受体（LNGFR），即p75受体。p75受体与NGF结合后不能直接活化内源性激酶，而是作为调节因子，增加TrkA与NGF的结合，同时它也可以调节细胞凋亡和迁移。NGF生理作用的发生与高亲和受体密切相关。

NGF和细胞膜受体结合形成NGF-NGF受体复合物，该复合物经内化后被运送到胞体，通过细胞内蛋白激酶系统，激活翻译机制，诱导合成多种多样的蛋白质，从而引起一系列生物学效应，如促进神经突起增加，结构蛋白增加等。

2.NGF受体相关的信号转导机制

NGF通过激动特异性受体原肌球蛋白激酶受体A（TrkA）（一种典型的酪氨酸激酶受体）来发挥其生物学作用。TrkA能通过其酪氨酸激酶区的酪氨酸磷酸化转导NGF信号。TrkA激活细胞内核所需要的蛋白酶（即靶蛋白）主要包括Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）和磷脂酶C（PLC）。NGF结合并激活低亲和力的非选择性的p75神经营养因子受体（p75NTR）。该受体由400个氨基酸构成，是一种调节TrkA信号的跨膜糖蛋白。其N末端在膜外部分是NGF的结合部位，NGF结合p75NTR后激活附加的信号通路，在缺乏TrkA表达的情况下，通过激活信号通路发生激酶信号级联反应，其最突出的功能是引导细胞凋亡，也有研究证实p75具有一些其他功能（包括促进细胞存活、神经轴突生长及细胞迁移等）。

研究已证实成骨细胞膜上有NGF的低亲和力受体（p75），骨源性和外源性的NGF都可与之结合激活高亲和力受体（TrkA），引起成骨细胞发生磷酸化，从而增强骨细胞活性，使成骨能力增加，促进骨的修复愈合。

3.NGF促进骨愈合的途径

成骨细胞的主要功能是合成分泌骨基质，并促进基质矿化形成骨组织。成骨细胞的生长分化大致经历三个阶段：生长增殖期；基质形成、成熟期，以碱性磷酸酶活性的升高、Ⅰ型胶原分泌为特征；基质钙化期，以骨钙蛋白分泌、钙离子沉积为特征。

研究发现外源性NGF的加入可以直接促进骨髓基质细胞碱性磷酸酶（ALP）的分泌，说明NGF可直接促进骨髓基质细胞（BMSCs）早期的成骨向分化。神经纤维对骨的生长发育有广泛的影响，完善的神经支配在骨的形成过程中起决定性的作用。降钙素基因相关肽（CGRP）几乎存在于所有的血管神经纤维内，是调节血管活动重要的肽能神经纤维。

有研究表明CGRP、P物质、神经肽Y等是沟通细胞器与细胞器、细胞与细胞之间的主要化学信使，它们能够作为一种神经递质或神经激素发挥相关作用，主要分布于骨代谢的活跃区域。并且发现破骨细胞和成骨细胞能在mRNA水平表达降钙素基因相关肽受体和神经肽Y受体。Grills等研究证明NGF可诱导交感和感觉神经纤维长入骨痂，释放神经递质，抑制骨吸收，刺激细胞有丝分裂和骨先质细胞分化，从而刺激骨的形成，交感神经纤维的支配增加可间接使血管的生成增多，促进骨化。孙嵩等通过NGF刺激（人骨肉瘤细胞）MG-63细胞检测CGRP的表达状况，发现在NGF作用下，MG-63细胞分泌的CGRP表达量明显上调，随NGF质量浓度升高及作用时间延长，CGRP表达量也相应升高，提示NGF参与骨创伤修复重建的方式可能是通过上调CGRP表达量来调节骨创伤修复过程。

NGF还能调节骨折愈合过程中的炎性细胞促进骨愈合，国外学者研究证明NGF浓度在组织炎症过程中会有所升高，炎症介质还会诱导NGF在多种细胞类型中合成。血管生成在新骨形成、骨再生及骨整合中具有十分重要的作用。骨矿化及成骨作用与血管生成紧紧相关。有研究表明NGF具有类似血管生长因子的功能。Guang等利用重组人NGF-β及血管内皮生长因子（VEGF）处理内皮细胞，将其置于两种不同的钛种植体表面（一种钛种植体表面经喷砂处理，另一种钛种植体表面经抛光处理），观察两种细胞因子对种植体周围微环境的影响。研究发现NGF在两种不同的种植体表面均可促进内皮细胞的增殖与粘附，上调与神经再生、血管生成、骨愈合相关基因mRNA的表达量。

4.NGF促进种植体周围骨结合的应用方式

NGF在种植体周围骨及神经修复的应用方式主要有3种：直接注射、缓释载体和改良种植体表面涂层结构。

4.1直接注射

目前，NGF的应用途径大多是局部注射法。Eppley等应用局部注射NGF修复兔下颌神经缺损实验中发现再生轴突周围有较多新生类骨质形成。Schuijers等用NGF局部注射治疗鼠肋骨骨折发现，骨痂生成增多，刚度和抗折强度亦显著增加。但是直接注射法容易导致NGF的活性丧失。

4.2缓释载体

由于直接注射容易导致NGF失效，许多研究开始集中在NGF载体的选择，以保持NGF的生物活性并发挥它的最大作用。目前，胶原类、高分子多聚物类、胶原/纳米羟基磷灰石、微型渗透泵等已被广泛研究和应用。

4.2.1胶原类

选择6只比格犬，分别拔除下颌双侧第一、二前磨牙，于远中拔牙窝行即刻种植，并在种植体近中制作5mm×3mm×5mm骨缺损。实验分3组：实验组植入神经生长因子-明胶海绵（NGF-GS）复合体（含NGF10μg），对照组不植入材料。应用标本大体、种植体骨磨片放射学及组织学观察，并进行骨计量学分析新生骨的面积百分比。结果显示术后未出现免疫反应。术后4、8周实验组种植体周围骨结合率明显高于对照组和空白组。NGF-GS复合体在种植体骨结合早期能够增加种植体周围新生骨小梁的面积，加速新生骨组织矿化，从而缩短骨结合时间，提高种植体骨结合率。

4.2.2高分子多聚物类

Butterfield等利用硫酸软骨素（CS）结合肽与聚乙二醇（PEG）共同制备凝胶状支架材料进行体外实验，实验分为4组：PEG凝胶、PEG+C6S凝胶、PEG+BP凝胶、PEG+BP+C6S凝胶各组。利用ELISA等方法测定NGF释放量与释放速度。发现PEG+C6S凝胶组释放NGF最快，PEG+BP+C6S凝胶组释放NGF最慢。在促进神经突生长方面，发现各加入NGF的样本中神经突的最大长度较未加入NGF的样本长。同时发现C6S有抑制神经突生长的作用，而NGF的加入会使其抑制作用解除，说明NGF具有促进神经突生长的作用。

4.2.3胶原/纳米羟基磷灰石

Letic-Gavrilovic等使用胶原/羟基磷灰石作为NGF-β的载体，将复合物植入20只Wistar小鼠颅骨缺损处用于成骨的研究，通过植入位点的临床、组织病理等方式研究发现，NGF有刺激骨膜、颅骨编织骨、薄层骨形成作用，增加其骨量，减少骨吸收。研究还发现NGF明显增强颅骨重塑能力，引导骨腔数量增加且体内外实验结论一致。同时该复合物在组织工程中作为生物相容性材料填补颅面部缺损有可观的优势。4.2.4应用微型渗透泵Grills等在雄性兔子肋骨骨折处皮对应的皮下植入微型渗透泵，实验组微型泵负载了10μgNGF，而对照组负载了等量生理盐水。微型泵以1.0μL/h的速率释放NGF，释放时间为7d。分别于7、21、42d处死实验组与对照组动物。通过标本大体、生物化学、组织学等评估发现实验组的去甲肾上腺素与肾上腺素浓度较对照组组均高，软骨组织形成及软骨内骨化较对照组普遍，而且新生骨获得的杨氏模量及致断应力较对照组均高。

Lee等基于韩国simplelineⅡ种植体设计了释放NGF型种植体。它是一种被设计为内部释放NGF的种植体，内部管腔的直径是1.3mm。种植体体部长度是8mm。利用该种植体体外研究肝素－纤维蛋白凝胶与NGF配比分析NGF在不同时间的释放量及其生物活性。实验A组为0.25μLNGF溶液，0.75μLHCF（heparin-conjugatedfibrin），1.0μL纤维蛋白和2.0μL凝血酶；B组为0.5μLNGF溶液，0.5μLHCF，1.0μL纤维蛋白和2.0μL凝血酶。混合液与凝胶一起注入种植体内部。将种植体与1mLPBS溶液放入2mL离心试管中，分别于1、3、5、7、10、14d更换试管内液体，利用ELISA测定试管内NGF释放量，利用PC12细胞测定神经突的生长及其生物活性。

研究发现两组NGF释放量在前5天成上升趋势，之后下降，但是B组在前3天释放很少，5～7d快速增加之后就迅速减少，而A组在14d之内呈逐步变化。几乎所有NGF在10d内释放，两组无明显差异。释放的NGF能促进神经突的生长并且活性保持在14d以上。

4.3改良种植体表面涂层结构

通过改良种植体表面涂层结构也是一种可以提高NGF缓释作用的新的方法。张鹏等通过将钛种植体浸泡于模拟体液中从而获得HA-钛种植体试件，然后将NGF与硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）混合，冷冻干燥后形成NGF-CS纳米颗粒，将形成的纳米颗粒与钛种植体试件共同浸泡于钙磷溶液中，获得HA-NGF钛种植体。利用该种植体试件进行体外实验发现其可以缓慢释放具有活性的NGF，提高种植体与周围骨组织的结合。

Hao等提出了一个种植体假想装置：种植体分为两个部分，与骨组织直接接触的部分为外壳，与基台连接并由微弹簧悬吊在外壳里面的为核心。外壳与核心之间的空间平均宽度为0.15mm，核心顶端设计为盘状，纵切面可见轮廓为弧形，该设计使核心受到非轴向力的时候能倾斜或绕中心旋转。种植体经喷砂、酸蚀、微氧化等步骤后，沉浸在含有鼠NGF的磷酸盐过饱和溶液中，从而种植体表面获得含NGF的蜂窝状涂层结构。利用微弹簧在种植体内部建立了一个缓冲器，目的是减少和分散集中在种植体周围的骨压力，种植体周围组织可由NGF引导神经再生及骨愈合，从而促进骨感知及骨结合。

5.小结与展望

NGF的半衰期较短，易受温度、pH等多种因素的影响，在水溶液中易丧失活性，药物浓度不稳定。将其物理吸附于支架材料，通过扩散及材料降解释放到周围环境，其释放时间较短，突释效应明显。理想的载体材料需有良好的生物相容性，有一定的强度和支架作用且与NGF的亲和性能好。还需要考虑其生物降解性、毒性等。利用改良种植体结构为NGF载体成为促进种植体周围骨愈合及神经再生新思路。但目前仍处于实验研究阶段，尚有许多问题待解决。NGF在外周神经系统病变中的临床应用较多，而口腔种植的临床应用尚缺乏，将NGF应用于口腔临床将是未来趋势。